RNA提取的實驗步驟及結果剖析

本文詳細介紹

RNA提取前的實驗準備、

RNA提取的

詳細實驗步驟,以及對RNA提取結果的剖析。

希望可以大家在做克隆和熒光定量時有所幫助!

注意:RNA提取也做到無菌操作的水平!

ⅠTrizol法

實驗原理

Trizol內含異硫氰酸胍能迅速破碎細胞,同時使核蛋白復合體中的蛋白變性并釋放出核酸;由于釋放出的DNA和RNA在特定pH值下的溶解度不同,且分別位于中間相和水相,從而使DNA和RNA得到分離;取出水相后,通過有機溶劑(氯仿)抽提及異丙醇沉淀,可得到純凈RNA。

預備實驗

1.DEPC簡介

DEPC是一種潛在的致癌物質,主要是能生成乙酯基衍生物和乙酯類衍生物,其中尿烷是一種已知的致癌物質。DEPC有刺激性,對眼睛和氣道粘膜有強刺激,在操作中應盡量在通風的條件下進行,DEPC毒性并不是很強,但吸入的毒性是最強的,使用時戴口罩,不小心占到手上注意立即沖洗。由于DEPC是一種酯類,較難溶于水,故通過加熱攪拌的方式來使其溶解。

2.1%的DEPC水的制備(1L)

取1mlDEPC于999ml去離子水中,37℃在磁力攪拌器上攪拌4h以上使其溶解。此溶液即1%DEPC水。

注意:

①DEPC與水反應后會產生大量的氣體,可用塑料膜將瓶口扎緊,劇烈混勻后通過觀察塑料膜是否脹氣來判斷反應是否充分

②DEPC水的量可以根據需要配制即可,原則上確保所有的物品都能浸在DEPC水中。

③制備的1%DEPC水,應留下100ml左右并裝入100ml左右的試劑瓶中,以備溶解RNA用。注意:根據試劑瓶的大小調節所留的DEPC水的量,原則是確保DEPC水能夠充滿整個試劑瓶,并且盛有DEPC水的試劑瓶也要放置過夜,然后高溫高壓滅菌使DEPC分解后才能用于溶解RNA。

④配制DEPC處理水時用棕色瓶。

3.離心管、各種大小的槍頭(1000ul、200/100ul、10ul)根據步驟及提取的量計算所需的個數,然后用制好的1%DEPC浸泡比計算數目略多的過夜處理。

注意①處理方法:用鑷子夾住離心管,然后浸入DEPC水中,使離心管中充滿液體,然后再倒出,反復2次,最后一次再浸入DEPC水后直接浸入其中,無需倒出。而槍頭則用最大量程的槍吸打DEPC水2次,最后一次吸入后不再打出,直接把槍頭推至DEPC水中。

②處理完畢后,離心管一般用一培養瓶盛裝,槍頭用槍頭盒盛裝,故DEPC處理時也應包含這些器皿。

4.研缽、研棒、試劑瓶、鑷子、廢液瓶等用錫箔紙包好口后200℃干熱滅菌4h。

5.RNA酶的來源。大量的微生物存在于空氣中、水中及物體的表面,當它們死亡時,會釋放大量的RNAase。對于人的皮膚、粘液、唾液等都因為直接或間接的與空氣接觸而攜帶有RNAase。

實驗步驟

主要參見trizol試劑的說明書,以下步驟僅供參考。

(1)取離心管做好標記,0.2g樣品液氮研磨成粉末狀,加1mlTrizol,漩渦混勻,室溫靜置5min。

可提前將離心管放液氮涼一會;一定要將材料研磨充分,且一旦研磨完畢立刻加入Trizol混勻。這一步是能否提出RNA的關鍵。

(2)加200μl氯仿,上下顛倒15s,室溫靜置3min。

提前打開冷凍離心機,若在夏季進行實驗需開啟制冷開關。

(3)12000 r/min 4℃離心15min。

(4)取離心管,樣品分三層(無色上清水相,中間白色層,粉色下層有機層)小心吸取無色上清至另一新離心管。

收集上清時應調小槍頭(50ul即可),緩慢吸取。

(5)加入等體積異丙醇,輕輕混勻,冰浴10-20min。

這段時間可以用滅菌處理的DEPC水配制75%乙醇。

(6)棄上清,用75%乙醇1ml懸浮沉淀。

(7)12000 r/min 4℃離心10min。

離心之前一定要懸浮沉淀,即指用移液槍將沉淀打起。

(8)棄上清,再短暫離心,用移液槍將殘余的乙醇吸出,沉淀于室溫下晾干。

晾干的標準是無酒精味即可。

(9)加入30-50μlDEPC處理的水溶解RNA。

提取完畢后分出2管,其中一管裝2ulRNA,用于濃度的測定;另一管裝2—5ul,用于電泳檢測。濃度測完后根據反轉錄的要求分裝小管,保證每一管符合反轉錄反應所需的RNA的質量。若用于半定量,則必須保證各樣品每管的質量均相同。

(10)電泳時用3%H2O2對電泳整個裝置消毒。

(11)取1—2ul進行電泳檢測及濃度檢測。

(12)分裝,-80℃保存。

注意事項

1.氯仿、異丙醇、乙醇都應用未開封的,75%的乙醇用移液槍配制,勿用量筒等中間器皿。

2.整個過程要及時更換手套,戴雙層口罩,并在操作區開啟酒精燈。

3.RNA一定要貯存到-70℃冰箱,在-20℃保存時間很短。

4.配制的溶液應用滅菌處理的DEPC水。

5. 移液器:RNase的又一污染源是移液器。根據移液器制造商的要求對移液器進行處理。一般情況下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗移液器的內部和外部,基本達到要求。

RNA提取結果的剖析

RNA提取,對于整個分子生物學實驗來說,算是比較有難度的操作了,提取出RNA如何判斷質量的好壞呢?那當然通過電泳圖了。下面將揭曉電泳圖上的秘密,幫助您更好的來提取RNA,提高成功概率。

1. RNA條帶不亮或缺失

(1)上樣量不足。

(2)染色劑不足或染色劑分布不均勻。

(3)RNA跑出凝膠。電泳至溴酚藍至凝膠的2/3即可停止電泳。另外電泳槽應水平放置,緩沖液要浸過凝膠,

(4)RNA在凝膠中發生擴散。避免長時間的電泳,否則小片段容易擴散。

(5)RNA降解。最大限度減少在紫外線下暴露的時間,使用新鮮的電泳緩沖液,新制的凝膠,電泳槽及制膠的模具梳子等用雙氧水浸泡,高電壓短時間電泳(20min)。也可能使用的組織材料不夠新鮮(冷凍的材料必須在化凍之前將其磨碎)。

2. RNA條帶彌散

(1)RNA被核酸酶降解。要用新的緩沖液,制膠用的模具要清潔,槍頭要滅菌。

(2)電泳條件不適合。避免長時間電泳,緩沖液要浸過凝膠,電壓要合適,不能過低。電壓過高,造成電流過大,也容易引起此現象的發生。一般5—8V/cm.(聚丙烯酰胺電泳多采用8V/cm)所以計算采用電壓時應先測量電泳槽兩電極之間的距離。為了增加條帶的清晰度,電泳開始的幾分鐘建議使用低電壓。

(3)上樣量過大。根據沉淀量的多少確定點樣的量,一般1—3ul。

(4)膠孔不規則。插梳子時應垂直插入,凝固后拔出梳子。

3. 背景很高

(1)核酸染劑加入的量過多。應按說明書添加。

4. 點樣孔發亮

(1)上樣量過大。

(2)膠孔未凝固好,使樣品無法往前移動。

(3)RNA樣品中含有污染物,如殘留的蛋白質容易引起此現象??赡躷rizol量太少,應加大trizol用量。另外若殘留DNA也應考慮加大trizol用量。

5. 出現多條帶

(1)RNA降解。提取過程中出現降解或電泳過程中出現降解(可能性較?。?。

(2)上樣量過大。RNA由多種類型組成,若上樣量過大則會導致各種類型的RNA(tRNA,mRNA等)均會出現條帶。

提取常見問題

1.研磨必須要充分,樣品用量要嚴格。

2.處理的槍頭離心管要量少多份,無RNAase的DEPC水也要量少多份,以備分裝RNA和調濃度使用。

3.電泳時間10-20min,不宜過長,電壓可為120-130V。

4.點樣用的10ul槍頭也要提前處理。

5.槍頭離心管90℃烘干5——6h。

6.電泳時,可以點樣Marker作陽性對照。

7.從-70℃冰箱中取出材料要在解凍之前迅速研磨。

8.提出的RNA可在70%酒精-70℃保存一年。

9.所有的東西必須有多余,防止出現用品的損失。

10.試劑瓶可以連續使用。

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